电脑没有诊断策略会怎么样(吴志英：诊断罕见病，临床医生应了解哪些基因筛查策略？)

基因诊断的好处颇多，主要可避免患者的误诊或漏诊，有助于精准诊断，从而指导后续的治疗方向，避免无效、有害的治疗。除此之外，基因诊断有助于评估患者复发的风险和疾病预后，及家庭成员的遗传咨询和产前干预。

2022首届中国罕见病科研及转化医学大会于11月11日在杭州开幕，一场聚焦罕见病领域科研及转化医学的权威、专业、多维度的学术交流盛宴顺利展开，在当日的“基础研究”专场，浙江大学医学院附属第二医院吴志英教授就“神经遗传病的基因诊断策略”发表了精彩演讲。

除外伤外，几乎所有疾病都与遗传因素有关。截止2021年底，已确定的人类孟德尔遗传病（单基因病）的致病基因共有4178个，其中83%的疾病与神经系统表型相关。疾病诊断可从临床诊断、生化诊断、基因诊断进行分层（图1），大多数疾病依据临床诊断即可确诊，部分疾病需要进行生化诊断，而针对一些罕见病，基因诊断是诊断的“金标准”。

图1.疾病分层

由此，吴志英教授提出疑问：当我们遇到一个遗传性的罕见病患者，应如何确定他的基因诊断策略？

吴志英教授总结归纳出3大要点：1.正确临床评估以启动基因检测；2.依据致病基因特点和基因检测技术制订最佳基因检测方案；3.通过临床表型匹配和家系验证进行精准的基因诊断。

以上要点也是临床上基因诊断的要点。基因检测流程主要有以下4步：在基因检测前，首先要拟定最佳基因检测方案，然后是样品准备和送检，接着进行基因检测与数据分析，最后进行致病性判读及基因诊断。

特征性的临床表现对诊断有重要的指向性作用，因此要完成第一步基因检测方案的制定，首先要对患者进行详细的临床评估。

通过仔细询问患者的病史和疾病进展过程，可辅助进行定性诊断；为患者认真体检，明确体征，可帮助进行定位诊断；若发现特殊的体征，可直接指向临床诊断。如发现角膜K-F环，需考虑肝豆状核变性；如发现鹤腿，需考虑腓骨肌萎缩症；如发现剪刀步态，需考虑痉挛性截瘫（图2）。

图2.特殊体征与临床诊断

此外，还应询问患者的家族史，绘制家系图，收集家系成员表型，以明确患者疾病的遗传模式。经过以上临床评估后，再按照患者的需要进行辅助检查，包括基因检测。

“不选最贵的，只选最对的。”吴志英教授在介绍如何选择最合适的基因检测方案时提出这一原则，“作为遗传病、罕见病的医生，我们必须熟悉疾病致病基因的突变特征，熟悉常见基因检测技术及其应用，才能给患者拟定最合理的基因检测方案。”

如致病基因是以单核苷酸突变为主，可能更适合Sanger法测序或全外显子组测序（WES）技术；如果患者的致病基因中带有动态突变，则毛细管电泳、重复引物聚合酶链式反应（PCR）技术便足够简单有效；如果患者的致病基因涉及拷贝数变异（CNV），多重连接探针扩增技术（MLPA）或染色体高通量测序（CNV-seq）会更合适。

表1常见的突变类型及其相应的检测方法

受检样品最常用患者的血液，如果患者患有线粒体疾病，宜选择肌肉、毛囊、尿液进行采集。应保留患者的DNA样品，为遗传家系验证备用；冻存患者的组织、细胞、RNA，为功能验证备用。随后按制定好的基因检测方案送检样品，进行基因检测。

吴志英教授介绍了目前的常用方法高通量基因检测二代测序技术。在检测完成后，首先会进行“变异初筛”，这一步由软件完成，筛选逻辑较为固定，分析一个样本仅需1-2分钟；接着进行“表型匹配”，需要专业的分析人员将患者的疾病表型与变异基因所致疾病的表型进行匹配；最后根据相关的致病性判断指南完成致病性判读。

如在致病性判读中遇到意义未名变异（VUS）的难题，最后一步的精确基因诊断就需要进行表性匹配和家系验证。

表性匹配需要将非结构化、自然语句的临床表现数据提炼为精简、唯一、计算机可识别的人类表型本体（HPO）标准化词条，再借助多种基因与疾病的关联算法，如Phenolyzer、Exomiser、TGex等实现自动化表型匹配。

而家系验证需要采集先证者更多家系成员的样品，建立样品库和数据库，以判读VUS的致病性，如果先证者和有疾病症状的家系成员都有相同VUS的致病变异，而正常的家系成员无携带，则家系共分离成功，可考虑遗传变异；如果家系共分离失败，则需考虑新生突变、外显率和表现度、嵌合体、追踪表型演变。

对于未检出但高度怀疑为基因病的的致病基因突变，患者需要定期重新分析数据。目前几乎每月甚至每周都有新致病基因被发现、报道，并且随着患者表型的变化，原来的临床诊断也可能被推翻。

在基因诊断的过程中，不仅新致病基因在不断更新，一些新技术、新方法的应用也在不断涌现。吴志英教授介绍到，虽然目前市面上大多数公司的NGS技术只能对DNA进行测序，但实际上NGS技术不仅可以进行DNA测序，还可进行RNA测序。

联合转录组测序技术（RNA-seq）去鉴定潜在剪接位点变异对mRNA的影响、鉴定一个功能丧失型变异是否经历无义介导的mRNA降解，能帮助我们寻找等位基因特异表达水平的证据，提高对患者诊断的阳性率。据报道，WGS+RNA-seq方案可额外提高7%的诊断阳性率（由31%到38%），RNA-seq还可帮助提高18%病例的致病性证据等级。

另外，基于“短读长测序”的二代测序技术（WES、WGS）对结构变异和长串联重复等复杂区域的变异常常无能为力。而基于“长读长测序（LRS）”的三代测序技术可为短读长测序阴性的病例提供更高分辨率的基因组图谱，使多核苷酸重复扩展突变研究取得全新的进展，这就是技术进步带来的益处。

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